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综述|数字PCR在新冠肺炎检测中的应用

发布日期:2021-01-14

摘要

2021新年伊始,光明日报报道,国际计量局近日在其网站上公布了新冠病毒核酸测量国际比对结果。比对结果表明,数字PCR法可在全世界范围内实现对新冠病毒核酸含量的高精确测量。该比对由中国计量院提出和联合主导,世界多个国家计量机构参与,有利于提高世界各国新冠病毒核酸测量结果的一致性和准确性。数字PCR,因为新冠病毒检测,走进了公众视野。


研究内容

近期,清华大学医学院生物医学工程系郭永团队在《VIEW》期刊发表了题为 “Applications of digital PCR in COVID-19 pandemic” 的综述文章。

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在这篇文章中,作者介绍了数字PCR的原理和优点,综述了数字PCR在COVID-19大流行中的应用,并讨论了数字PCR在COVID-19及相关临床应用中的挑战。


基于液滴数字PCR的SARS-CoV-2检测工作流程:

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A:配制含有靶标检测引物和探针的混合液,SARS-CoV-2检测中多使用Taqman探针法,以N基因和ORF1ab基因作为靶点;B:采用微流控芯片生成油包水液滴;C:收集液滴至PCR管中;D:使用热循环仪进行液滴PCR扩增,扩增后,原包含有靶标核酸分子的液滴内部的核酸量将达到百亿量级,靶标分子在扩增的过程中和荧光基团结合,使其能接受光信号的激发并释放荧光信号;E:液滴逐个通过由激光光源和光电检测的检测位,不包含靶标分子的液滴的被激发光信号较弱(阴性液滴),包含有荧光靶标分子的被激发光信号较强(阳性液滴),同时对阴阳性液滴进行计数;F:基于泊松分布,计算原始靶标分子的浓度,图中散点的位置代表了携带不同靶标的液滴。


数字PCR优势:

1)绝对定量:通过对反应单元的微分、终点检测和泊松分布数学模型,在不依赖标准品的前提下,可实现对靶标分子的绝对定量;

2)更高的灵敏度:对反应单元进行微分的同时,降低了每个反应单元中非靶标分子的占比,从而提高了靶标分子的扩增效率和检测灵敏度,对一些稀有突变的检出率可以提高到0.001%;

3)更好的稳定性:微分反应单元的同时也对PCR反应抑制剂进行了稀释,因此数字PCR显示出比荧光定量PCR(qPCR)更好的抑制剂耐受性,可以在复杂样品的检测中实现更好的检出;

4)更高的精度:在区分更细微的拷贝数差异时,与qPCR相比,数字PCR表现出更好的区分能力,结果具有更小的变异系数(CV值)。


数字PCR,在COVID-19诊断和治疗中发挥重要的作用:

1)对SARS-CoV-2的高敏检测:尽管逆转录荧光定量PCR(RT-qPCR)方法是目前COVID-19诊断的金标准,但其被报道存在假阴性率高的问题,而数字PCR的检测限(LoD)比RT-qPCR更低,在一些临床样本的检出中,数字PCR检测结果跟临床诊断的结果一致性比RT-qPCR更好,因此对于低病毒载量样品的检测,数字PCR可作为RT-qPCR的重要补充。

2)评估不同类型的临床样本的病毒载量:COVID-19测试可使用多种类型的临床样品,包括鼻拭子、咽拭子、痰液、血液、尿液、粪便和支气管肺泡灌洗液等,选择合适的样本类型对于准确的临床诊断至关重要。数字PCR可对上述样本中的病毒载量进行定量,Yu等人的研究发现,痰液中病毒载量最高,其次是鼻拭子和咽拭子,提示了使用痰液和鼻咽拭子作为测试样本能够增加阳性检出率。

3)样本制备方法评估:安全处理疑似COVID-19病例的样本对于保护医学实验室人员免受感染伤害至关重要。Chen等人使用数字PCR定量三种灭活方法处理前后样本中的病毒量,结果表明灭活处理会降低可检测的病毒RNA的数量,可能导致假阴性结果;而且相比热灭活,使用TRIzol试剂灭活对病毒RNA的影响最小。这项研究表明,数字PCR可作为评估核酸样本预处理效果的有效方法。

4)动态监测疾病进展:在临床管理和治疗中,密切监视病人的病情进展非常重要。对于大多数病毒感染引起的疾病,病毒载量越高,疾病病情越重。因此,研究病毒载量与COVID-19严重程度之间的关系非常重要,数字PCR的高灵敏和高精度使其能够监测患者病毒载量的变化。Yu等使用了数字PCR来定量检测样本中的病毒载量,结果显示患者在整个疾病过程中的不同时间点病毒载量有差异,疾病早期和进展期的病毒载量明显高于恢复期,说明动态监测病毒载量变化有助于评估疾病的进展。

5)核酸参考品的制备:数字PCR可以对核酸进行绝对定量,因此,它已被用于标定核酸参考物质。例如,van Kasteren等用数字PCR定量SARS-CoV-2的拷贝数,用于制备标准物质,并将RNA进行梯度稀释以评估不同RT-qPCR试剂盒的分析性能。Fung等用数字PCR检测阳性患者样本中的病毒载量并准备了系列梯度稀释液,以确定7种SARS-CoV-2检测方法的LoD。因此,数字PCR可为国家机构,例如国家食品药品监督管理局、中国计量科学研究院或者企业单位制备SARS-CoV-2核酸标准品提供可靠方法。

6)监测环境中病毒浓度:对公共环境中存在的病毒进行监测是新冠预防和控制的重要环节,Liu等使用数字PCR检测新冠爆发期间武汉两家医院不同区域气溶胶中的病毒RNA,发现在大多数情况下无法在公共区域检测到SARS-CoV-2 RNA;气溶胶中病毒RNA的浓度在隔离病房和通风病房较低,但是在病人及医疗工作人员使用的厕所区域较高,根据这些结果,他们认为SARS-CoV-2可能通过气溶胶传播。Lv等使用RT-qPCR和数字PCR检测残留在实验室相关物体表面的病毒,例如样品运输和接待相关设施、测试仪器和个人防护设备等。RT-qPCR检测结果显示所有样本均为阴性,而61个样本中 数字PCR检测出13份样本为阳性;SARS-CoV-2 RNA密度最高的是处理病毒样本的实验室人员的手套外侧。这些研究表明,数字PCR可以监测在不同的环境中病毒RNA,为疾病预防和消毒策略提供依据。

7)SARS-CoV-2突变的检测:RNA病毒具有很高的突变率,这与毒力和进化能力相关。病毒突变研究对于评估病毒耐药性、了解与免疫有关的逃逸机制和发病机理至关重要。Wong等开发了基于数字PCR的检测方法来检测Vero-E6传播的分离株、人类类器官、实验感染的仓鼠和COVID-19患者样本中的PRRA位点或位点上游缺失变异;PRRA缺失的蝙蝠状冠状病毒变异体可以在COVID-19患者中自然存在,而且仍然可以传播,但这些变异在自然感染中的频率较低,表明它们的竞争性不如插入PRRA的野生型。这项研究表明数字PCR适用于检测已知的SARS-CoV-2突变,尤其是针对一些低频突变的检测。

8)抗SARS-CoV-2病毒药物的评估:病毒载量的减少是抗病毒药的有效性的重要指标,例如,在瑞德西韦针对成人重症COVID-19患者的一项研究中, Wang等监测了受试者呼吸道标本的病毒载量,以确定药物是否可以加速病毒载量的下降或降低病毒检出率;此外,Zhu等人监测了患者的病毒载量变化来评估阿比多尔和洛匹那韦/利托那韦治疗COVID-19的治疗效果。其中Wang等人通过标准曲线确定病毒载量,Zhu等人仅使用Ct值来表现病毒载量的变化。由于数字PCR能够实现不依赖标准曲线的绝对定量,而且能够检测到拷贝数的微小差异,作者认为数字PCR比RT-qPCR更适合用于评价抗SARS-CoV-2药物的有效性,能够给出更具说服力和准确的评价结果。


总结:

作为一种新兴的绝对定量技术,数字PCR对低丰度DNA更加灵敏和特异,能够绝对定量,对扩增抑制剂的抗性更强。数字PCR的技术优势在SARS-CoV-2的核酸检测中得到了完整的体现,在低拷贝病毒样本检测、临床样本病毒载量定量、参考品制备、环境中病毒浓度定量、病毒突变检测和药物评价等多方面扮演了重要的角色。


在临床检测中,数字PCR仍有进步空间:

1)通量:数字PCR系统的样品检测通量需要进一步提高,以满足COVID-19大规模筛查的需求;

2)自动化:需要操作流程更简单、自动化程度更高的数字PCR系统来简化复杂的操作过程,减少手动操作时间;

3)成本:需要进一步降低仪器及试剂耗材的成本,提高市场竞争力;

4)标准及批文:需要制定国家或行业统一标准,推出商品化的室内质控品;多中心评估:基于数字PCR的SARS-CoV-2核酸检测试剂盒需要经过多中心性能评估测试、获得相关监管部门批准(FDA/NMPA等),才能为临床诊断提供合规依据。

新羿生物新型冠状病毒 2019-nCoV 核酸定量检测解决方案

面对新冠疫情,新羿生物充分发挥科技优势,其团队凭借丰富的重大疾病诊断技术研究经验,春节无休开发出高灵敏度的新冠核酸检测试剂盒,提供了新冠病毒精准诊断的利器。

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新羿TD-1数字PCR平台

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新冠病毒 2019-nCoV 核酸检测试剂盒


新羿生物新冠解决方案特点

1. 灵敏度高:最低检测下限100 copies/mL;

2. 定量准确:无需标准品和标准曲线;

3. 通量较高:一次PCR可以完成96样本;

4. 操作简便:一步上样,操作简单;

5. 封闭检测:全封闭体系检测,可防止气溶胶污染,预防假阳性;

6. 特异性好:与其他常见呼吸道病原体(病毒、细菌、真菌)无交叉反应。

论文链接:DOI: 10.1002/VIW.20200082

光明日报文章链接:

参考文献:(略)