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制药应用 | 数字PCR检测生物药酵母细胞残留DNA

发布日期:2021-08-13

酵母细胞特别是毕赤酵母,是目前生产蛋白质类药物的常用宿主细胞。宿主细胞残留的DNA是生产工艺过程中的杂质,须对药物纯化工艺后的残留DNA进行监测和去除,以确保药物的纯度和安全性。目前,基于荧光定量PCR(qPCR)的方法被广泛应用于宿主细胞残留DNA的定量检测。数字PCR(dPCR)技术在这个领域的应用也在不断发展,它比qPCR具有更高的灵敏度和绝对定量能力。与qPCR相比,用dPCR方法可以从大量药物中检测到含量更低的酵母细胞DNA残留,显示了更高的灵敏度,并且该方法拥有较好的检测精密度和准确度。

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研究背景

许多蛋白质类药物如胰岛素等是在酵母细胞中制备的,然而宿主细胞产生的DNA杂质对患者用药构成安全隐患,各国监管机构对蛋白质类药物中DNA杂质的限量要求及其严格。大多数生物类药物厂商将蛋白质药物中宿主细胞残留DNA的标准定在每毫克药物≤1.0 pg。因此,使用一种非常灵敏的DNA检测和定量方法十分重要。

方法与结果

将Merck公司生产的蛋白质类药物人重组IgG-Fc(RP-1)药物和Sigma公司制备的胰岛素配置成50 mg/mL的溶液,这两种生物药的宿主细胞均是酵母细胞,毕赤酵母总DNA在缓冲液中配制成31 μg/mL。直接将RP-1和胰岛素加入到数字PCR反应体系当中,每个反应体系包含11 μL 2x Supermix、2.2 μL 10x引物和探针、8.8 μL的水做阴性对照或3.3 μL毕赤酵母DNA和5.5 μL的蛋白质药物(或者水)。随后将体系分割成纳米级的微滴,进行PCR扩增,然后检测荧光信号并对药物中酵母细胞残留DNA进行定量分析。


DNA Std (fg):

酵母细胞DNA量,6000、600、60、6、0 fg

DNA Std+RP-1:

酵母细胞DNA加25 μg RP-1

DNA Std+Insulin:

酵母细胞DNA加50 μg 胰岛素

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图1

数字PCR检测RP-1和胰岛素中毕赤酵母细胞残留DNA线性范围

总结

1. 数字PCR对细胞残留DNA的检测灵敏度可以达到qPCR的5倍或以上,可以满足每1 mg蛋白质药物中≤1 pg宿主细胞DNA残留检测的要求。

2. 数字PCR作为一种精确、灵敏的检测方法,无需DNA标准曲线,可以直接定量检测RP-1和胰岛素生物药中酵母细胞残留DNA。

3. 该方法同样适用于其他生物药中宿主细胞DNA残留检测。


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